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Untersuchung der Bedeutung von Chromosomen- und Genomstruktur in der Entstehung von chromosomaler Instabilität und Leukämieauslösenden Translokationenlocations.

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Antragsteller

Dr. Vassilis Roukos

Institut für Molekulare Biologie gGmbH 

https://www.imb.de/research/roukos/research/

Zusammenfassung

Molekulare Vorgänge, die entlang der DNA stattfinden, verändern die Topologie der DNA maßgeblich. Diese Veränderungen im ChromatinKontext müssen zudem mit der Organisation der Chromosomen wie zum Beispiel der Entstehung von Chromatinschlaufen („chromatin loops“) und der hierarchischen Architektur des Genoms koordiniert werden. Spannung durch Verdrillung der DNA an Genom-Ankerpunkten, wie Promotoren und Grenzen von Chromatinschlaufen, wird von speziellen Enzymen,Topoisomerasen, aufgelöst. Typ II Topoisomerasen (TOP2s) schneiden dabei beide Stränge der Duplex-DNA, um Superverdrillung und Verknotungen der DNA zu lösen. Die Verwendung weitverbreiteter Chemotherapeutika, sogenannten Topoisomerase-Giften, verhindert den Abschluss der enzymatischen Reaktion der TOP2s und stabilisiert dadurch die Bindung des Proteinkomplex an die DNA. Dadurch werden chromosomale Brüche in wiederkehrenden, fragilen Bereichen und somit die Entstehung von chromosomalen Translokationen begünstigt, die in direkter Verbindung zu sekundären, therapie-induzierten Leukämien stehen. Welche zellulären Vorgänge in der Umwandlung von stabilisierten TOP2-DNAKomplexen zu krebserregenden DNA-Brüchen führen, ist allerdings ungeklärt. 

Basierend auf unseren vorläufigen Ergebnissen nehmen wir an, dass Transkription und Mechanismen, die die Chromosomenstruktur beeinflussen, wesentlich zu der Brüchigkeit von Chromosomen und der Entstehung krebserregender Translokationen beitragen. Unser Ziel ist daher eine Untersuchung des Einflusses der dreidimensionalen Chromosomen- und Genomstruktur auf zwei Aspekte der Entstehung von wiederkehrenden Translokationen: (1) die Auswirkung von Spannungen, die während der Bildung von Chromatinschlaufen entstehen, auf Chromosomenstabilität, und (2) die Auswirkung räumlicher Genomstruktur auf die Synapse gebrochener DNA-Enden, einem entscheidenden Schritt in der Formation von Chromosomenveränderungen und der Wahl beteiligter Chromosomen. Wir werden den Einfluss der Bildung von Chromatinschlaufen auf TOP2assoziierte Genominstabilität analysieren, indem wir state-of-the-art Sequenzierungsverfahren anwenden, mit denen DNA-Doppelstrangbrüche im gesamten Genom erkannt und analysiert werden können. Diese werden wir in humanen Zellsystemen verwenden, in denen die Aus- und Rückbildung von Chromatinschlaufen kontrolliert werden kann. Des Weiteren werden wir eine kausale Verbindung der 3D Genomarchitektur und der Bildung chromosomaler Translokationen untersuchen, indem wir eine High-Throughput-Mikroskopiemethode verwenden, um Synapsen, Doppelstrangbrüche und Konjugationen von Chromosomen zu identifizieren und zu quantifizieren. Hierbei wird Einzelzellanalyse verbunden mit der präzisen Veränderung des Genoms mittels Cas9, um die Aktivität von Genen zu modellieren und Chromatinveränderungen vorzunehmen. Wir hoffen, dass unser Projektvorschlag die 3D Genomarchitektur in Verbindung mit der zellulären Entstehung von wiederkehrenden, krebserregenden Translokationen bringt.